【摘要】小动物可见光活体成像技术是一项技术应用广、实用性强的生物医学研究手段，但由于实验设备要求高，相关仪器贵重，目前尚缺乏相关课程应用到研究生技能教学中。本课程利用国家级教学实验平台，系统性地针对医学研究生开展了小动物活体成像技术应用与操作这门课程，利用16个理论学时，14个实践学时全面系统地完成课程教育，最终达到研究生能够独立熟练地完成相关实验技能。
　　【关键词】小动物活体成像  技能培训  研究生教学
　　【基金项目】海军军医大学重点课程建设项目“小动物活体成像技术与应用”。
　　【中图分类号】G64  【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2021）07-0014-02
　　小动物可见光活体成像技术是采用生物发光与荧光两种方式，利用高灵敏度的光学检测仪器直接检测动物活体体内的细胞活动和基因行为，利用该技术可以检测活体动物体内肿瘤的生长和转移、炎症的发生、特定基因的表达和药物研究、细胞凋亡及流行病学等领域的研究。但由于小动物可见光活体成像设备稀缺贵重，在高校的研究生课程中一般不设立该课程的理论和技能教学。然而，随着生物医学研究的深入与发展，小动物可见光活体成像技术在科学研究中的应用越来越普遍，已成为一项常规的生物实验技术手段。所以本课程通过利用国家级教学实验中心的平台设备，开展技术应用广泛、实用性强的小动物可见光活体成像技术的研究生技能教学。
　　目前，高等院校利用自身已有平台开展具有实践价值，能够快速促进研究生投入科研工作的技能教学课程已成为一项重要的研究生培养教育改革内容。实验技能是医学研究生不可缺乏的基本技能，在研究生课程学习阶段推广深入技能实践培训有利于研究生快速进入科研状态。小动物可见光活体成像技术的技能教学应用到研究生培养中，对高校研究生教育培养有积极的推动作用。
　　一、材料与方法
　　1.仪器设备
　　Bio-Real公司的Quickview 3000小动物活体成像系统;ESCO公司的细胞培养箱;BIOBASE公司的生物安全柜。
　　2.实验试剂与材料
　　免疫缺陷裸鼠购于上海杰思捷实验动物有限公司;荧光素钾盐购于上海碧云天生物技术有限公司;肿瘤细胞株购于上海研酶生物科技有限公司;細胞培养基购于上海雁金生物科技有限公司。
　　3.实验步骤
　　步骤1：目标基因及荧光素酶基因或者荧光蛋白基因导入到实验需要的细胞内。可以将学生分成两组，一组学生使用荧光素酶标记的细胞株，另一组学生使用荧光蛋白标记的细胞株，让学生在后续实验中了解两种方法的特点和差异。
　　步骤2：筛选出稳定表达荧光素酶或者荧光蛋白的细胞。步骤1和步骤2根据课时要求可以让学生使用已经构建好的细胞株。将准备好的细胞株复苏，扩增，根据细胞数量将细胞以不同数量种于96孔板内，贴壁后利用小动物活体成像仪确定能够检测的细胞量阈值。
　　步骤3：细胞扩增到足够量之后，将细胞消化，使用培养基重悬后计数（可以让学生学习细胞计数的方法），按照每个部位107细胞量接种肿瘤细胞，荷瘤小鼠一般选用免疫缺陷的裸鼠，荷瘤部位一般选择躯干两侧接近腋下的部位，荷瘤时注意注射器穿刺的深浅，以形成表皮的皮丘为宜。
　　步骤4：肿瘤细胞接种一周后，基本可以肉眼观察到肿瘤的生长，可以定期使用Bio-real小动物成像仪观察荷瘤小鼠肿瘤的大小以及生长情况。
　　步骤5：准备好待测小动物、实验材料，并稀释萤光素钾盐溶液至工作浓度。
　　步骤6：打开小动物活体成像仪及电脑，打开软件，点击生物发光模式，在此期间CCD会降温至-80℃。在降温时，向麻醉泵中注入适量异氟烷，调节麻醉剂和氧气阀门，麻醉剂调至2刻度，氧气调至3刻度，打开控制麻醉剂的三通管阀门，使小动物麻醉箱中充入异氟烷。
　　步骤7：将适量萤光素钾盐注入（尾静脉/腹腔）到小鼠体内后，控制好时间，一般腹腔注射15min后，将小鼠放入到麻醉箱中，进行诱导麻醉。（如果是荧光蛋白无需此操作）
　　步骤8：小鼠麻醉后，打开通向成像系统的麻醉管阀门，打开麻醉盒取出小鼠，将小鼠放入到观察位置上，并将小鼠嘴部对准麻醉孔，同时将小鼠摆出适宜观察的姿势，关闭通向麻醉盒的阀门，关闭仪器封闭门。
　　步骤9：打开focus按钮，观察小鼠放置情况，调整视野的大小，打开平台控温板，保证小鼠在37℃条件下维持体温。打开生物发光，设置曝光时间（一般30～60s）、放大倍数（超过500则没有意义）。
　　步骤10：点击start，开始测定，也可选择连续曝光。
　　步骤11：在得到的图像上，可观察得到数据，进入软件分析系统，自动或手动计算发光强度。点击export，保存图像及数据到固定文件夹。
　　步骤12：关闭仪器前，点击cool off，使CCD升温到0℃以上方可关闭仪器及电脑。
　　二、实验原理
　　1.荧光成像原理
　　荧光物质的分子在受到能量的激发后，其核外电子从基态跃迁到激发态，而激发态的电子处于高能量状态，并不稳定，其可以通过释放光子的形式回到基态，在这个过程中发射出的光子称之为荧光。不同的物质的激发光和发射光的广谱有所不同，需要检测的设备具备相应的滤光片。荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础。
　　2.生物发光的原理
　　将萤光素酶基因整合到细胞的基因组当中去，让细胞可以稳定表达萤光素酶，当外源性的给与细胞或者动物萤光素酶的底物时，同时在细胞中ATP的参与下，，萤光素酶催化底物与ATP发生化学反应产生光子，称之为生物发光。发光的强度与标记的细胞数量呈线性关系，通过检测发错生物光的强度来评价细胞的数量水平。